Egy lelkész hét gyereke közül a legidősebbként látta meg a napvilágot Lancasterben. Már kisgyermekként kitűnt rendkívüli emlékezetével, tízévesen kívülről megtanult egy gyerekeknek írt ismeretterjesztő könyvet, amelyből még évtizedekkel később is hibátlanul idézett oldalakat. Kezdetben a geometria érdekelte és mérnöknek készült, saját kis műhelyében hajómodelleket, működő fényképezőgépet fabrikált. Az elektroncső feltalálója 1870-ben diplomázott Londonban, majd kémiát hallgatott, első tudományos publikációját Alessandro Volta elektromos eleméről írta és az elsők között tervezett hajókra villanyvilágítást. Anyagi nehézségei miatt tanítani kényszerült, mellette azonban folytatta kutatásait. 1877-ben beiratkozott a Cambridge-i Egyetemre, ahol fizikából és kémiából is diplomát szerzett, 1885-től 1927-es nyugdíjazásáig a londoni University College professzora volt.
Az 1880-as években az Edison alapította Electric Light Company londoni részlegének tanácsadója volt, és a telefont feltaláló Alexander Graham Bell vállalatával is dolgozott. Amikor az olasz Guglielmo Marconi, a drótnélküli távíró feltalálója 1899-ben a fejébe vette, hogy rádiókapcsolatot létesít Anglia és az Egyesült Államok között, a cél érdekében Fleminget alkalmazta. Az őáltala tervezett adóberendezés tette lehetővé az első transzatlanti rádióadást 1901. december 12-én, de korszakalkotó munkájáért csak szerény honoráriumot kapott, mivel a rádióösszeköttetést biztosító technológiáért járó anyagi elismerés Marconit illette, és a szűkmarkú olasz még a megígért részvényeket sem adta neki oda.
Fleming a neves skót fizikus, James Clerk Maxwell tanítványa volt, a fotometria és a nagyfeszültségű áram kérdései mellett az elektromágnesesség is érdekelte. 1890-től vizsgálta az úgynevezett Edison-effektust, amelyet az amerikai feltaláló 1878-ban figyelt meg: eszerint
Fleming a jelenséget kihasználva készítette el az első gyakorlatban is alkalmazható diódát: a légüres csőformában két elektróda található, az anód az áramforrás pozitív, a katód a negatív sarkával van összekötve, és mivel az áram csak az egyik irányban tud folyni benne, alkalmas az egyenirányításra.
Találmányát elektroncső, vákuumdióda, kenotron és Fleming-detektor neveken is emlegetik, ő maga termionikus szelepnek nevezte.
Az 1904-ben szabadalmaztatott eszközzel a váltóáramú rádiójeleket telefonhallgatóval érzékelhető, gyenge egyenáramú jelekké lehetett alakítani, ezzel Fleming forradalmasította a drótnélküli távírást és lerakta az elektronika alapjait. A technológia bekerült a rádióvevőkbe, majd később a radarokba is, az elektronika területén számos más fejlesztés alapjává vált.
Fleming az 1910-es években tökéletesítette találmányát és annak alkalmazásán dolgozott. A nevéhez fűződik többek közt a vezetőben folyó egyenáram által létrehozott mágneses tér irányának meghatározására szolgáló elektrodinamikai jobbkéz-szabály. Eredményeiért számos díjat kapott, 1929-ben lovagi címmel jutalmazták.
Tudományos tevékenysége mellett a művészetek is érdekelték, fotózással és festészettel foglalkozott.
Jelentős szerepet vállalt az evolúció elméletét tagadó kreacionista mozgalomban, és Nagy-Britannia Filozófiai Társaságának elnöke volt 1927 és 1942 között. Több mint száz tanulmányt publikált. Az elektromos hullámtelegráfia című műve 1906-ban, az Elektromos áramok terjedése telefon- és távíróvezetékekben 1911-ben jelent meg.
Sir John Ambrose Fleming 1945. április 18-án, 95 éves korában hunyt el Sidmouthban.
(Nemzeti Archívum Sajtóarchívum)